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            國際前沿科技

            Cell最牛解析:揭秘CRISPR“中心法則”,一圖了解CRISPR系統作用全步驟!

            2015-10-20

            來源:生物通 2015-10-19 

            2007年,來自丹尼斯克公司(一家總部位于丹麥哥本哈根的食品添加劑公司,目前被杜邦公司收購)的科學家找到了一種能增強細菌防御噬菌體能力的方法。之后2013年,四個研究團隊報告了這一被稱為CRISPR的系統,自此CRISPR技術紅紅火火的發展了起來,許多科研團隊利用它來刪除、添加、激活或抑制人體、老鼠、斑馬魚、細菌、果蠅、酵母、線蟲和農作物細胞中的目標基因。

            近期來自蒙大拿州立大學的兩位學者以“CRISPR-RNA-Guided Adaptive Immune Systems”為題,介紹了CRISPR-Cas免疫應答系統。其中Blake Wiedenheft就是當年加州大學伯克利分校Jennifer Doudna研究組成員,他們曾于2010年破解了Csy4核糖核酸內切酶原子水平的晶體結構模型——研究人員確定Csy4是一種存在于原核細胞的酶,它能夠啟動生成CRISPR衍生RNAs (crRNAs),這種小RNA分子能夠靶向并沉默侵入的病毒和質粒。

            細菌和古細菌進化出了復雜的CRISPR適應性免疫系統,這一系統可以分成I-III三個類型,至少有11種不同的亞型:從I-A到I-F,從II-A到II-C,以及III-A和III-B,不過盡管有這些不同,所有的CRISPR-Cas系統都通過三個主要階段來完成功能:采集,CRISPR RNA(crRNA) 生物合成與靶向干擾。

            階段1:外源DNA采集

            外源核苷酸是通過Cas蛋白來識別的,入侵的短片段DNA(30-50個堿基對)被稱為protospacers,作為間隔序列插入宿主CRISPR位點中,由重復序列隔開。對于I型和II型系統來說,protospacers來自入侵DNA中兩側出現2-5個核酸結構(PAM,protospacer adjacent motif)的區域。一般protospacers連接在CRISPR 位點的一端,并且后者通過涉及Cas1、Cas2和游離3’-hydroxyls等元件的機制,牽引序列。Protospacer的整合過程中也出現了牽引末端重新序列復制,這可能涉及宿主聚合酶和DNA修復機制。

            相關論文解析:

            Multiple mechanisms for CRISPR–Cas inhibition by anti-CRISPR proteins

            研究人員確定了其中三種anti-CRISPR蛋白:AcrF1、AcrF2和AcrF3的功能機制。他們對這些蛋白進行了生物化學及體內研究,證實每一個anti-CRISPR蛋白都通過不同的機制來抑制了CRISPR–Cas的活性。有兩個anti-CRISPR阻斷了CRISPR–Cas復合物的DNA結合活性,但它們是通過與不同的蛋白質亞基互作,利用了空間或非空間抑制模式來做到這一點的。第三種anti-CRISPR蛋白通過結合Cas3解螺旋酶-核酸酶,阻止其招募到結合DNA的CRISPR–Cas復合物上來起作用。在體內,這一anti-CRISPR可以將CRISPR–Cas系統轉變為轉錄遏制物,首次證實了一種蛋白質相互作用蛋白可以調控CRISPR–Cas活性。作者們認為,這些anti-CRISPR蛋白質不同的序列及作用機制表明了獨立的進化,并預示了還存在其他的方式——蛋白質借助于它們改變了CRISPR–Cas的功能。

            新研究首次探討了蛋白質抑制CRISPR–Cas系統的機制。這些多樣且不同的機制反映了病毒-宿主軍備競賽深層的進化根源。這些已知和尚有待發現的Anti-CRISPR,將為認識和操控CRISPR–Cas系統提供大量有價值的工具。其中一個例子就是,新研究發現AcrF3通過阻止招募Cas3將CRISPR–Cas系統轉變為了一個基因調控因子。由于除了破壞外源DNA,CRISPR–Cas系統來執行著各種功能,許多重要的功能有可能是由與CRISPR–Cas元件互作,由此改變了這一系統活性的蛋白質來完成。

            階段2:crRNA合成

            CRISPR RNA生物合成在轉錄之后,生成初級轉錄產物:pre-crRNA,之后經過加工,又成為一組短小的CRISPR 衍生RNAs(crRNAs),這些crRNAs每一個都包含有對應于之前遇到的外源DNA的對應序列。

            CrRNAs導向序列兩端是相鄰重復序列區域,在I型和II型系統中,這種CRISPR轉錄產物會被CRISPR特異性核酸內切酶(Cas6 或 Cas5d)切割,切割位點位于重新序列。許多I型系統的重新序列會出現多次,因此Cas6也需要穩定連接在crRNA 3’端莖環上。對于III型系統來說,Cas6則是短暫連接,crRNA 3’端會進一步通過未知的酶處理。

            II型系統中,CRISPR RNA加工過程則取決于反式作用 crRNA (tracrRNA),tracrRNA包含一個重復序列的互補序列,這些雙螺旋區域在Cas9出現時可以通過RNase III 進行處理。

            相關論文解析:

            CRISPR-mediated adaptive immune systems in bacteria and archaea.

            這篇發表在Annu. Rev. Biochem. 雜志上的文章十分重要,解析了crRNA合成過程,以及其后的靶向干擾中的幾個重要步驟,此后也被多人引用。

            Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering

            張鋒的這篇綜述概述了CRISPR/Cas9作為一種平臺技術的開發狀況以及在基因組編輯方面的應用,也討論了其存在的一些挑戰,以及未來的創新之路。

            階段3:靶向干擾

            成熟的crRNAs能指導Cas蛋白靶向互補靶標,靶標序列由專用Cas 核酸酶降解,但其靶標降解的機制存在差異。I型和II型系統都可以靶向包含PAM和protospacer互補序列的dsDNA底物。III型系統則不依賴于 PAM作為識別序列,而是通過導向序列延伸至crRNA信號5'handle的核苷酸進行識別(CRISPR位點包含與導向序列,5'handle互補的序列),并阻止靶向切割。

            相關論文解析:

            Co-transcriptional DNA and RNA Cleavage during Type III CRISPR-Cas Immunity

            一些數據表明,當病毒入侵細菌細胞時,稱作為III型CRISPR-Cas的這一機制會靶向病毒的DNA,阻止它利用細菌的機器來拷貝自身及感染更多的細菌。但另外的一些實驗表明,III型CRISPR-Cas只能通過切割病毒RNA來讓病毒喪失能力。

            洛克菲勒大學的研究人員他們檢測了III型CRISPR-Cas對DNA和RNA的切割,結果發現了從前其他人沒有得到過的一個關鍵成分,并發現CRISPR-Cas確實切割了病毒DNA生成的RNA,但它也切割了病毒的DNA。

            這種雙交叉系統有一些優勢。許多的病毒整合到它們感染細胞的基因組中保持休眠狀態,不會造成損傷。事實上,這些病毒對于細菌可能是有益的,例如它們攜帶的毒素幫助了細菌促進自身生存。舉例說來,白喉毒素是由一種細菌所分泌,但編碼這一毒素的基因卻來自于一種病毒。只有在病毒開始將它們的DNA轉錄為RNA之時才會讓它們喪失功能,通過設置這樣的要求III型CRISPR-Cas不會損及休眠病毒,使得它們可以繼續讓宿主細菌受益。

            循環關閉

            I型系統中,監測復合物中靶向結合會導致Cas3介導的靶向降解(直接干擾)或最初采集,這其中涉及crRNA導向募集Cas3、Cas1 和Cas2到外源DNA處,引起新一輪的快速采集。

            II型系統中雖然未觀察到最初采集,但Cas9 也是protospacer篩選的必要元件,這表明在靶向干擾與外源DNA采集之間存在一種功能性聯系。近期還有研究發現了編碼anti-CRISPRs 蛋白的不同病毒基因,這也是指出了干擾以上不同階段,能顛覆CRISPRs 系統。

            Cas9 specifies functional viral targets during CRISPR-Cas adaptation.

            一些證據表明,某些Cas酶(未包括Cas9)自身可以操控記憶形成過程?;贑as9識別切割位點的方式,研究人員猜測Cas9在記憶形成中也發揮了作用。

            除了匹配CRISPR引導序列和病毒DNA,Cas9需要在附近尋找第二信號:病毒DNA中的前間區序列鄰近基序( protospacer adjacent motif,PAM)序列。這是一個至關重要的步驟,因為PAM序列的存在阻止了Cas9攻擊細菌自身包含記憶的DNA。

            為了檢驗他們的假說,研究人員交換了化膿鏈球菌和嗜熱鏈球菌免疫系統的Cas9酶,它們各自識別不同的PAM序列。結果,PAM序列跟隨著在兩種細菌之間發生了交換——表明在記憶形成中Cas9負責了PAM的識別。

            Multiple mechanisms for CRISPR–Cas inhibition by anti-CRISPR proteins

            研究人員確定了其中三種anti-CRISPR蛋白:AcrF1、AcrF2和AcrF3的功能機制。他們對這些蛋白進行了生物化學及體內研究,證實每一個anti-CRISPR蛋白都通過不同的機制來抑制了CRISPR–Cas的活性。有兩個anti-CRISPR阻斷了CRISPR–Cas復合物的DNA結合活性,但它們是通過與不同的蛋白質亞基互作,利用了空間或非空間抑制模式來做到這一點的。第三種anti-CRISPR蛋白通過結合Cas3解螺旋酶-核酸酶,阻止其招募到結合DNA的CRISPR–Cas復合物上來起作用。在體內,這一anti-CRISPR可以將CRISPR–Cas系統轉變為轉錄遏制物,首次證實了一種蛋白質相互作用蛋白可以調控CRISPR–Cas活性。作者們認為,這些anti-CRISPR蛋白質不同的序列及作用機制表明了獨立的進化,并預示了還存在其他的方式——蛋白質借助于它們改變了CRISPR–Cas的功能。

            新研究首次探討了蛋白質抑制CRISPR–Cas系統的機制。這些多樣且不同的機制反映了病毒-宿主軍備競賽深層的進化根源。這些已知和尚有待發現的Anti-CRISPR,將為認識和操控CRISPR–Cas系統提供大量有價值的工具。其中一個例子就是,新研究發現AcrF3通過阻止招募Cas3將CRISPR–Cas系統轉變為了一個基因調控因子。由于除了破壞外源DNA,CRISPR–Cas系統來執行著各種功能,許多重要的功能有可能是由與CRISPR–Cas元件互作,由此改變了這一系統活性的蛋白質來完成。(力太生物.com)

            推薦的英文原文

            SnapShot: CRISPR-RNA-Guided Adaptive Immune Systems

            DOI:http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2015.09.011

            Bacteria and archaea have evolved sophisticated adaptive immune systems that reply on CRISPR loci and a diverse cassette of Cas genes that are classified into three main types and at least eleven subtypes. All CRISPR-Cas immune systems operate through three main stages: acquisition, biogenesis, and interference. This SnapShot summarizes our current knowledge of these fascinating immune systems. To view this SnapShot, open or download the PDF


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